Die Auflösung eines Lichtmikroskops beträgt. Auflösungsvermögen und Auflösungsgrenze des Mikroskops
Mikroskope werden zum Nachweis und zur Untersuchung von Mikroorganismen eingesetzt. Lichtmikroskope dienen der Untersuchung von Mikroorganismen mit einer Größe von mindestens 0,2 Mikrometern (Bakterien, Protozoen usw.) und Elektronenmikroskope dienen der Untersuchung kleinerer Mikroorganismen (Viren) und kleinster Bakterienstrukturen.
Modern Lichtmikroskope- es handelt sich um komplexe optische Instrumente, deren Handhabung bestimmte Kenntnisse, Fähigkeiten und große Sorgfalt erfordert.
Lichtmikroskope werden in Studenten-, Arbeits-, Labor- und Forschungsmikroskope unterteilt und unterscheiden sich in Design und Optik. Haushaltsmikroskope (Biolam, Bimam, Mikmed) haben Bezeichnungen, die angeben, zu welcher Gruppe sie gehören (S – Student, R – Arbeiter, L – Labor, I – Forschung), die Ausrüstung ist durch eine Nummer gekennzeichnet.
Ein Mikroskop besteht aus mechanischen und optischen Teilen.
ZU mechanisches Teil Dazu gehören: ein Stativ (bestehend aus einer Basis und einem Tubushalter) und einem darauf montierten Tubus mit Revolver zum Anbringen und Wechseln von Objektiven, eine Bühne für die Vorbereitung, Vorrichtungen zum Anbringen eines Kondensors und Lichtfiltern sowie eingebaute Mechanismen das Stativ für Grob (Makromechanismus, Makroschraube) und Fein
(Mikromechanismus, Mikroschraube) Bewegen des Objekttisches oder Rohrhalters.
Optischer Teil Das Mikroskop besteht aus Objektiven, Okularen und einem Beleuchtungssystem, das wiederum aus einem Abbe-Kondensor unter dem Tisch, einem Spiegel mit flacher und konkaver Seite sowie einer separaten oder eingebauten Beleuchtung besteht. Die Linsen werden in den Revolver eingeschraubt und auf der gegenüberliegenden Seite des Tubus das entsprechende Okular montiert, durch das das Bild beobachtet wird. Es gibt monokulare (mit einem Okular) und binokulare (mit zwei identischen Okularen) Tuben.
Schematische Darstellung eines Mikroskops und Beleuchtungssystems
1. Lichtquelle;
2. Sammler;
3. Irisfeldblende;
4. Spiegel;
5. Irisblende;
6. Kondensator;
7. Droge;
7". Vergrößertes reales Zwischenbild des Präparats, erzeugt durch: Linse;
7"". Vergrößertes virtuelles Endbild der Probe durch das Okular gesehen;
8. Linse;
9. Symbol für die Objektivausgabe;
10. Leuchtfeldblende des Okulars;
11. Okular;
12. Auge.
Die Hauptrolle bei der Bildbeschaffung spielt Linse. Es erstellt ein vergrößertes, reales und invertiertes Bild eines Objekts. Dieses Bild wird dann bei Betrachtung durch ein Okular noch weiter vergrößert, wodurch, ähnlich wie bei einer normalen Lupe, ein vergrößertes virtuelles Bild entsteht.
Zunahme Die ungefähre Vergrößerung eines Mikroskops lässt sich ermitteln, indem man die Vergrößerung des Objektivs mit der Vergrößerung des Okulars multipliziert. Die Vergrößerung bestimmt jedoch nicht die Bildqualität. Die Qualität des Bildes, seine Klarheit, wird bestimmt Auflösung des Mikroskops, d. h. die Fähigkeit, zwei nahe beieinander liegende Punkte getrennt zu unterscheiden. Auflösungsgrenze- der Mindestabstand, bei dem diese Punkte noch einzeln sichtbar sind - hängt von der Wellenlänge des Lichts ab, mit dem das Objekt beleuchtet wird, und von der numerischen Apertur des Objektivs. Die numerische Apertur wiederum hängt von der Winkelöffnung des Objektivs und dem Brechungsindex des Mediums ab, das sich zwischen der Frontlinse des Objektivs und der Probe befindet. Der Öffnungswinkel ist der maximale Winkel, in dem Strahlen, die durch ein Objekt hindurchgehen, in das Objektiv eintreten können. Je größer die Apertur und je näher der Brechungsindex des Mediums zwischen Linse und Probe am Brechungsindex von Glas liegt, desto höher ist das Auflösungsvermögen der Linse. Wenn wir davon ausgehen, dass die Apertur des Kondensors gleich der Apertur des Objektivs ist, sieht die Auflösungsformel wie folgt aus:
wobei R die Auflösungsgrenze ist; - Wellenlänge; NA – numerische Apertur.
Unterscheiden nützlich Und nutzlos Zunahme. Die nutzbare Vergrößerung entspricht normalerweise der numerischen Apertur des Objektivs bei 500- bis 1000-facher Vergrößerung. Eine höhere Okularvergrößerung bringt keine neuen Details zum Vorschein und ist nutzlos.
Abhängig von der Umgebung, die sich zwischen Objektiv und Objekt befindet, gibt es „trockene“ Objektive mit kleiner und mittlerer Vergrößerung (bis 40-fach) und Immersionsobjektive mit maximaler Blende und Vergrößerung (90-100-fach). Eine „trockene“ Linse ist eine Linse mit Luft zwischen der Frontlinse und der Probe.
Ein Merkmal von Immersionslinsen besteht darin, dass zwischen der Frontlinse einer solchen Linse und dem Präparat eine Immersionsflüssigkeit platziert wird, deren Brechungsindex dem von Glas entspricht (oder diesem nahekommt), wodurch die numerische Apertur und Auflösung des Objektivs erhöht wird Linse. Als Immersionsflüssigkeit für Wasserimmersionsobjektive wird destilliertes Wasser und für Ölimmersionsobjektive Zedernöl oder spezielles synthetisches Immersionsöl verwendet. Die Verwendung von synthetischem Immersionsöl ist vorzuziehen, da seine Parameter genauer standardisiert sind und es im Gegensatz zu Zedernöl nicht auf der Oberfläche der Frontlinse des Objektivs austrocknet. Für Linsen, die im ultravioletten Bereich des Spektrums arbeiten, wird Glycerin als Immersionsflüssigkeit verwendet. Auf keinen Fall sollten Sie Ersatzstoffe für Immersionsöl und insbesondere Vaselineöl verwenden.
**Das mit Linsen erhaltene Bild weist verschiedene Nachteile auf: sphärische und chromatische Aberrationen, Krümmung des Bildfeldes usw. Bei Linsen, die aus mehreren Linsen bestehen, werden diese Mängel in gewissem Maße korrigiert. Abhängig vom Grad der Korrektur dieser Mängel werden Achromaten von komplexeren Apochromaten unterschieden. Dementsprechend werden Objektive, bei denen die Krümmung des Bildfeldes korrigiert wird, Planchromate und Planapochromate genannt. Die Verwendung dieser Objektive erzeugt ein scharfes Bild im gesamten Sichtfeld, wohingegen das mit herkömmlichen Objektiven erhaltene Bild in der Mitte und an den Rändern des Sichtfelds nicht gleich scharf ist. Alle Eigenschaften des Objektivs sind normalerweise in den Rahmen eingraviert: seine eigene Vergrößerung, Blende, Objektivtyp (APO – Apochromat usw.); Wasserimmersionslinsen haben die Bezeichnung VI und einen weißen Ring um den Rahmen im unteren Teil, Ölimmersionslinsen haben die Bezeichnung MI und einen schwarzen Ring.
Alle Objektive sind für die Verwendung mit Deckglas mit einer Dicke von 0,17 mm ausgelegt.
Die Dicke des Deckglases beeinflusst insbesondere die Bildqualität bei der Arbeit mit starken Trockensystemen (40 x). Beim Arbeiten mit Immersionsobjektiven können Sie keine Deckgläser mit einer Dicke von mehr als 0,17 mm verwenden, da die Dicke des Deckglases möglicherweise größer ist als der Arbeitsabstand des Objektivs und in diesem Fall, wenn Sie versuchen, das Objektiv auf die Probe zu fokussieren, die Vorderseite Die Linse des Objektivs kann beschädigt werden.
Okulare bestehen aus zwei Linsen und sind auch in verschiedenen Ausführungen erhältlich, die jeweils mit einem bestimmten Linsentyp verwendet werden, wodurch Bildmängel weiter vermieden werden. Der Okulartyp und die Vergrößerung sind auf dem Rahmen angegeben.
Der Kondensor dient dazu, das Licht des Beleuchtungsgeräts auf die Probe zu fokussieren, das vom Spiegel des Mikroskops oder des Beleuchtungsgeräts (bei Verwendung eines Overhead- oder eingebauten Beleuchtungsgeräts) gelenkt wird. Einer der Teile des Kondensors ist die Aperturblende, die für die richtige Beleuchtung des Arzneimittels wichtig ist.
Der Illuminator besteht aus einer Niedervolt-Glühlampe mit dickem Glühfaden, einem Transformator, einer Kollektorlinse und einer Feldblende, deren Öffnung den Durchmesser des beleuchteten Feldes auf dem Präparat bestimmt. Der Spiegel leitet das Licht vom Illuminator zum Kondensor. Um die Parallelität der vom Illuminator zum Kondensor kommenden Strahlen aufrechtzuerhalten, ist es notwendig, nur die flache Seite des Spiegels zu verwenden.
Beleuchtung einrichten und Mikroskop fokussieren
Die Qualität des Bildes hängt auch maßgeblich von der richtigen Beleuchtung ab. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, eine Probe für die Mikroskopie zu beleuchten. Der häufigste Weg ist Köhler Lichtinstallationen Das ist wie folgt:
1) Installieren Sie den Illuminator am Mikroskopspiegel.
2) Schalten Sie die Beleuchtungslampe ein und richten Sie das Licht auf den flachen (!) Spiegel des Mikroskops;
3) Platzieren Sie das Präparat auf dem Mikroskoptisch.
4) Decken Sie den Mikroskopspiegel mit einem Stück weißem Papier ab und fokussieren Sie das Bild des Lampenfadens darauf, indem Sie die Lampenfassung im Illuminator bewegen.
5) Entfernen Sie das Blatt Papier vom Spiegel;
6) Schließen Sie die Aperturblende des Kondensors. Durch Bewegen des Spiegels und leichtes Verschieben der Lampenfassung wird das Bild des Glühfadens auf die Aperturblende fokussiert. Der Abstand der Beleuchtung zum Mikroskop sollte so sein, dass das Bild des Lampenfadens dem Durchmesser der Aperturblende des Kondensors entspricht (die Aperturblende kann mit einem flachen Spiegel beobachtet werden, der auf der rechten Seite der Basis angebracht ist). das Mikroskop).
7) Öffnen Sie die Aperturblende des Kondensors, verringern Sie die Öffnung der Feldblende des Illuminators und reduzieren Sie die Lampenintensität erheblich;
8) Bei geringer Vergrößerung (10x) erhält man beim Blick durch das Okular ein scharfes Bild des Präparats;
9) Durch leichtes Drehen des Spiegels wird das Bild der Leuchtfeldblende, das wie ein heller Fleck aussieht, in die Mitte des Sichtfeldes übertragen. Durch Absenken und Anheben des Kondensors erhält man ein scharfes Bild der Ränder der Feldblende in der Präparatebene (um sie herum kann ein farbiger Rand sichtbar sein);
10) Öffnen Sie die Feldblende des Illuminators bis zu den Rändern des Sichtfelds, erhöhen Sie die Glühfadenintensität der Lampe und verringern Sie leicht (um 1/3) die Öffnung der Kondensator-Aperturblende;
11) Beim Objektivwechsel müssen Sie die Lichteinstellungen überprüfen.
Nach Abschluss der Köhler-Lichteinstellung können Sie die Position des Kondensors und die Öffnung der Feld- und Aperturblende nicht mehr ändern. Die Beleuchtung des Arzneimittels kann nur mit Neutralfiltern oder durch Änderung der Lampenintensität mit einem Rheostat eingestellt werden. Eine übermäßige Öffnung der Aperturblende des Kondensors kann zu einer erheblichen Verringerung des Bildkontrasts führen, und eine unzureichende Öffnung kann zu einer erheblichen Verschlechterung der Bildqualität (Auftreten von Beugungsringen) führen. Um die korrekte Öffnung der Aperturblende zu überprüfen, ist es notwendig, das Okular abzunehmen und es beim Blick in den Tubus so zu öffnen, dass es das Leuchtfeld zu einem Drittel abdeckt. Um die Probe beim Arbeiten mit Objektiven mit geringer Vergrößerung (bis zu 10-fach) richtig auszuleuchten, muss die obere Kondensorlinse abgeschraubt und entfernt werden.
Aufmerksamkeit! Wenn Sie mit Objektiven arbeiten, die eine hohe Vergrößerung bieten – bei starken Trocken- (40x) und Immersionssystemen (90x), verwenden Sie beim Fokussieren die folgende Technik, um die Frontlinse nicht zu beschädigen: Von der Seite schauend senken Sie das Objektiv mit einem Makro ab Drehen Sie die Schraube fast bis zum Kontakt mit der Probe, heben Sie dann mit Blick auf das Okular mit einer Makroschraube die Linse sehr langsam an, bis ein Bild erscheint, und führen Sie mit einer Mikroschraube die endgültige Fokussierung des Mikroskops durch.
Mikroskoppflege
Wenden Sie beim Arbeiten mit einem Mikroskop keine große Kraft an. Berühren Sie die Oberflächen von Linsen, Spiegeln und Filtern nicht mit den Fingern.
Um die Innenflächen der Linsen sowie die Prismen des Tubus vor Staub zu schützen, müssen Sie das Okular immer im Tubus belassen. Beim Reinigen der Außenflächen von Linsen müssen Sie den Staub mit einer weichen, in Äther gewaschenen Bürste entfernen. Wischen Sie die Linsenoberflächen bei Bedarf vorsichtig mit einem gut gewaschenen, seifenfreien Leinen- oder Batisttuch ab, das leicht mit reinem Benzin, Äther oder einer speziellen Mischung zur Reinigung von Optiken angefeuchtet ist. Es wird nicht empfohlen, die Linsenoptiken mit Xylol abzuwischen, da sie dadurch auseinanderfallen können.
Von Spiegeln mit Außenversilberung können Sie Staub nur durch Abblasen mit einem Gummiball entfernen. Sie können nicht abgewischt werden. Sie können die Linsen auch nicht selbst abschrauben oder demontieren – dies führt zu deren Beschädigung. Nach Abschluss der Arbeiten am Mikroskop ist es erforderlich, das restliche Immersionsöl vorsichtig mit der oben angegebenen Methode von der vorderen Objektivlinse zu entfernen. Anschließend senken Sie den Tisch (bzw. den Kondensor bei Mikroskopen mit festem Tisch) ab und decken das Mikroskop mit einer Abdeckung ab.
Um das Aussehen des Mikroskops zu erhalten, ist es notwendig, es regelmäßig mit einem weichen, leicht in säurefreier Vaseline getränkten Tuch und anschließend mit einem trockenen, weichen und sauberen Tuch abzuwischen.
Neben der herkömmlichen Lichtmikroskopie gibt es Mikroskopiemethoden, die die Untersuchung ungefärbter Mikroorganismen ermöglichen: Phasenkontrast , dunkles Feld Und leuchtend Mikroskopie. Um Mikroorganismen und ihre Strukturen zu untersuchen, deren Größe geringer ist als die Auflösung eines Lichtmikroskops, verwenden Sie
Wie Sie wissen, erhält ein Mensch den Großteil der Informationen über die Welt um ihn herum durch das Sehen. Das menschliche Auge ist ein komplexes und perfektes Gerät. Dieses von der Natur geschaffene Gerät arbeitet mit Licht – elektromagnetischer Strahlung, deren Wellenlängenbereich zwischen 400 und 760 Nanometern liegt. Die Farbe, die ein Mensch wahrnimmt, wechselt von Lila zu Rot.
Elektromagnetische Wellen, die dem sichtbaren Licht entsprechen, interagieren mit den elektronischen Hüllen von Atomen und Molekülen im Auge. Das Ergebnis dieser Wechselwirkung hängt vom Zustand der Elektronen in diesen Schalen ab. Licht kann absorbiert, reflektiert oder gestreut werden. Was genau mit dem Licht passiert ist, kann viel über die Atome und Moleküle verraten, mit denen es interagierte. Der Größenbereich von Atomen und Molekülen reicht von 0,1 bis zu mehreren zehn Nanometern. Diese ist um ein Vielfaches kürzer als die Wellenlänge des Lichts. Allerdings sind Objekte genau dieser Größe – nennen wir sie Nanoobjekte – sehr wichtig zu sehen. Was muss hierfür getan werden? Lassen Sie uns zunächst besprechen, was das menschliche Auge sehen kann.
Wenn es um die Auflösung eines bestimmten optischen Geräts geht, gehen sie normalerweise von zwei Konzepten aus. Das eine ist die Winkelauflösung und das andere die lineare Auflösung. Diese Konzepte hängen miteinander zusammen. Für das menschliche Auge beträgt die Winkelauflösung beispielsweise etwa 1 Bogenminute. In diesem Fall kann das Auge zwei Punktobjekte, die 25–30 cm von ihm entfernt sind, nur dann unterscheiden, wenn der Abstand zwischen diesen Objekten mehr als 0,075 mm beträgt. Dies ist durchaus vergleichbar mit der Auflösung eines herkömmlichen Computerscanners. Tatsächlich bedeutet die Auflösung von 600 dpi, dass der Scanner Punkte unterscheiden kann, die nur 0,042 mm voneinander entfernt sind.
Um Objekte in noch geringerem Abstand voneinander unterscheiden zu können, wurde ein optisches Mikroskop erfunden – ein Gerät, das die Auflösung des Auges erhöht. Diese Geräte sehen anders aus (wie in Abbildung 1 zu sehen), ihr Funktionsprinzip ist jedoch dasselbe. Das optische Mikroskop ermöglichte es, die Auflösungsgrenze auf Bruchteile eines Mikrometers zu verschieben. Bereits vor 100 Jahren ermöglichte die optische Mikroskopie die Untersuchung mikrometergroßer Objekte. Gleichzeitig wurde jedoch klar, dass eine weitere Erhöhung der Auflösung nicht durch eine einfache Erhöhung der Anzahl der Objektive und eine Verbesserung ihrer Qualität erreicht werden konnte. Es stellte sich heraus, dass die Auflösung eines optischen Mikroskops durch die Eigenschaften des Lichts selbst, nämlich seine Wellennatur, begrenzt ist.
Ende des vorletzten Jahrhunderts wurde festgestellt, dass die Auflösung eines optischen Mikroskops . In dieser Formel ist λ die Wellenlänge des Lichts und N Sünde u- die numerische Apertur des Mikroskopobjektivs, die sowohl das Mikroskop als auch die Substanz charakterisiert, die sich zwischen dem Untersuchungsobjekt und dem nächstgelegenen Mikroskopobjektiv befindet. Tatsächlich beinhaltet der Ausdruck für die numerische Apertur den Brechungsindex N Umgebung zwischen Objekt und Objektiv und den Winkel u zwischen der optischen Achse der Linse und den äußersten Strahlen, die das Objekt verlassen und in die Linse eindringen können. Der Brechungsindex des Vakuums ist gleich eins. Für Luft liegt dieser Indikator sehr nahe bei eins, für Wasser bei 1,33303 und für spezielle Flüssigkeiten, die in der Mikroskopie verwendet werden, um maximale Auflösung zu erreichen, N erreicht 1,78. Egal aus welchem Blickwinkel u, der Wert Sünde u kann nicht mehr als eins sein. Daher überschreitet die Auflösung eines optischen Mikroskops nicht einen Bruchteil der Lichtwellenlänge.
Als Auflösung wird im Allgemeinen die halbe Wellenlänge angenommen.
Intensität, Auflösung und Vergrößerung eines Objekts sind verschiedene Dinge. Sie können festlegen, dass der Abstand zwischen den Bildmitten von Objekten, die 10 nm voneinander entfernt sind, 1 mm beträgt. Dies entspräche einer Steigerung um das 100.000-fache. Es wird jedoch nicht möglich sein, zu unterscheiden, ob es sich um ein oder zwei Objekte handelt. Tatsache ist, dass Bilder von Objekten, deren Abmessungen im Vergleich zur Wellenlänge des Lichts sehr klein sind, unabhängig von der Form der Objekte selbst die gleiche Form und Größe haben. Solche Objekte nennt man Punktobjekte – ihre Größe kann vernachlässigt werden. Wenn ein solches Punktobjekt leuchtet, wird es im optischen Mikroskop als heller Kreis dargestellt, der von hellen und dunklen Ringen umgeben ist. Wir werden der Einfachheit halber weiterhin Lichtquellen betrachten. Ein typisches Bild einer Punktlichtquelle, das mit einem optischen Mikroskop aufgenommen wurde, ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Intensität der Lichtringe ist viel geringer als die des Kreises und nimmt mit der Entfernung von der Bildmitte ab. Meistens ist nur der erste Lichtring sichtbar. Der Durchmesser des ersten dunklen Rings beträgt . Die Funktion, die diese Intensitätsverteilung beschreibt, wird Punktspreizfunktion genannt. Diese Funktion ist unabhängig von der Vergrößerung. Das Bild mehrerer Punktobjekte besteht genau aus Kreisen und Ringen, wie in Abbildung 3 zu sehen ist. Das resultierende Bild kann vergrößert werden, wenn jedoch die Bilder zweier benachbarter Punktobjekte zusammengeführt werden, verschmelzen sie weiterhin. Diese Art der Vergrößerung wird oft als nutzlos bezeichnet – größere Bilder werden einfach unschärfer. Ein Beispiel für eine nutzlose Vergrößerung ist in Abbildung 4 dargestellt. Die Formel wird oft als Beugungsgrenze bezeichnet und ist so berühmt, dass sie in das Denkmal des Autors dieser Formel, des deutschen optischen Physikers Ernst Abbe, eingraviert wurde.
Natürlich wurden optische Mikroskope im Laufe der Zeit mit einer Vielzahl von Geräten ausgestattet, die die Speicherung von Bildern ermöglichten. Das menschliche Auge wurde zunächst durch Filmkameras und Filme ergänzt, dann durch Kameras auf Basis digitaler Geräte, die das auf sie fallende Licht in elektrische Signale umwandeln. Die gebräuchlichsten dieser Geräte sind CCD-Matrizen (CCD steht für Charge-Coupled Device). Die Anzahl der Pixel in Digitalkameras nimmt immer weiter zu, die Auflösung optischer Mikroskope allein kann dadurch jedoch nicht verbessert werden.
Noch vor 25 Jahren schien es, dass die Beugungsgrenze unüberwindbar sei und dass man auf das Licht als solches verzichten müsse, um Objekte zu untersuchen, deren Abmessungen um ein Vielfaches kleiner als die Wellenlänge des Lichts seien. Genau diesen Weg haben die Erfinder der Elektronen- und Röntgenmikroskope eingeschlagen. Trotz der zahlreichen Vorteile solcher Mikroskope blieb das Problem der Verwendung von Licht zur Betrachtung von Nanoobjekten bestehen. Dafür gab es viele Gründe: Bequemlichkeit und Leichtigkeit beim Arbeiten mit Objekten, der kurze Zeitaufwand für die Erstellung eines Bildes, bekannte Methoden zum Einfärben von Mustern und vieles mehr. Nach Jahren harter Arbeit wurde es schließlich möglich, nanoskalige Objekte mit einem optischen Mikroskop zu betrachten. Die größten Fortschritte in dieser Richtung wurden im Bereich der Fluoreszenzmikroskopie erzielt. Natürlich hat niemand die Beugungsgrenze aufgehoben, aber sie haben es geschafft, sie zu umgehen. Derzeit gibt es verschiedene optische Mikroskope, die es ermöglichen, Objekte zu untersuchen, deren Abmessungen viel kleiner sind als die Wellenlänge des Lichts, das Bilder dieser Objekte erzeugt. Alle diese Geräte haben ein gemeinsames Prinzip. Versuchen wir zu erklären, um welches es sich handelt.
Aus dem, was bereits über die Beugungsgrenze der Auflösung gesagt wurde, geht hervor, dass es nicht so schwierig ist, eine Punktquelle zu erkennen. Wenn diese Quelle eine ausreichende Intensität aufweist, ist ihr Bild deutlich sichtbar. Form und Größe dieses Bildes werden, wie bereits erwähnt, durch die Eigenschaften des optischen Systems bestimmt. Wenn Sie gleichzeitig die Eigenschaften des optischen Systems kennen und sicher sind, dass es sich bei dem Objekt um ein Punktobjekt handelt, können Sie gleichzeitig genau bestimmen, wo sich das Objekt befindet. Die Genauigkeit der Koordinatenbestimmung eines solchen Objekts ist recht hoch. Dies lässt sich anhand von Abbildung 5 veranschaulichen. Die Koordinaten eines Punktobjekts lassen sich umso genauer bestimmen, je intensiver es leuchtet. Bereits in den 80er Jahren des letzten Jahrhunderts konnten sie mit einem optischen Mikroskop die Position einzelner leuchtender Moleküle mit einer Genauigkeit von 10–20 Nanometern bestimmen. Eine notwendige Voraussetzung für eine solch genaue Bestimmung der Koordinaten einer Punktquelle ist ihre Einsamkeit. Die nächstgelegene andere Punktquelle muss so weit entfernt sein, dass der Forscher sicher weiß, dass das verarbeitete Bild einer Quelle entspricht. Es ist klar, dass dies eine Distanz ist l muss die Bedingung erfüllen. In diesem Fall kann die Bildanalyse sehr genaue Informationen über die Position der Quelle selbst liefern.
Die meisten Objekte, deren Abmessungen viel kleiner sind als die Auflösung eines optischen Mikroskops, können als eine Reihe von Punktquellen dargestellt werden. Die Lichtquellen in einem solchen Satz sind in Abständen voneinander angeordnet, die viel kleiner als sind. Wenn diese Quellen gleichzeitig leuchten, ist es unmöglich, etwas über ihren genauen Standort zu sagen. Wenn man diese Quellen jedoch nacheinander zum Leuchten bringen kann, kann die Position jeder einzelnen Quelle mit hoher Genauigkeit bestimmt werden. Wenn diese Genauigkeit den Abstand zwischen den Quellen übersteigt, kann man, wenn man die Position jeder einzelnen Quelle kennt, herausfinden, wie ihre relative Position ist. Dies bedeutet, dass Informationen über die Form und Größe des Objekts gewonnen wurden, die als eine Reihe von Punktquellen dargestellt werden. Mit anderen Worten: In diesem Fall können Sie mit einem optischen Mikroskop ein Objekt untersuchen, dessen Abmessungen kleiner als die Beugungsgrenze sind!
Der entscheidende Punkt besteht also darin, unabhängig voneinander Informationen über verschiedene Teile eines Nanoobjekts zu erhalten. Hierzu gibt es drei Hauptgruppen von Methoden.
Die erste Gruppe von Methoden bringt gezielt den einen oder anderen Teil des Untersuchungsobjekts zum Leuchten. Die bekannteste dieser Methoden ist die optische Nahfeld-Rastermikroskopie. Schauen wir es uns genauer an.
Wenn Sie die Bedingungen, die mit der Beugungsgrenze einhergehen, genau studieren, werden Sie feststellen, dass die Abstände von Objekten zu Linsen deutlich größer sind als die Wellenlänge des Lichts. Bei Abständen, die mit dieser Wellenlänge vergleichbar und kleiner sind, ist das Bild anders. In der Nähe jedes Objekts, das im elektromagnetischen Feld einer Lichtwelle gefangen ist, befindet sich ein elektromagnetisches Wechselfeld, dessen Änderungsfrequenz mit der Änderungsfrequenz des Feldes in der Lichtwelle übereinstimmt. Im Gegensatz zu einer Lichtwelle lässt dieses Feld schnell nach, wenn es sich vom Nanoobjekt entfernt. Der Abstand, bei dem die Intensität abnimmt, z.B. e Zeiten, vergleichbar mit der Größe des Objekts. Somit ist das elektromagnetische Feld optischer Frequenz in einem Raumvolumen konzentriert, dessen Größe viel kleiner ist als die Wellenlänge des Lichts. Jedes Nanoobjekt, das in diesen Bereich fällt, interagiert auf die eine oder andere Weise mit dem konzentrierten Feld. Wenn das Objekt, mit dessen Hilfe diese Feldkonzentration durchgeführt wird, sequentiell entlang einer beliebigen Flugbahn entlang des untersuchten Nanoobjekts bewegt und das von diesem System emittierte Licht aufgezeichnet wird, kann aus einzelnen auf dieser Flugbahn liegenden Punkten ein Bild erstellt werden. Natürlich sieht das Bild an jedem Punkt so aus, wie in Abbildung 2 gezeigt, aber die Auflösung hängt davon ab, wie stark das Feld konzentriert wurde. Und diese wiederum wird durch die Größe des Objekts bestimmt, mit dessen Hilfe dieses Feld konzentriert wird.
Die gebräuchlichste Methode, das Feld auf diese Weise zu konzentrieren, besteht darin, ein sehr kleines Loch in einen Metallschirm zu bohren. Typischerweise befindet sich dieses Loch am Ende eines spitzen Lichtleiters, der mit einer dünnen Metallschicht beschichtet ist (der Lichtleiter wird oft als optische Faser bezeichnet und wird häufig zur Datenübertragung über große Entfernungen verwendet). Nun ist es möglich, Löcher mit Durchmessern von 30 bis 100 nm herzustellen. Die Auflösung ist gleich groß. Geräte, die nach diesem Prinzip arbeiten, werden optische Nahfeld-Rastermikroskope genannt. Sie erschienen vor 25 Jahren.
Das Wesentliche der zweiten Methodengruppe ist Folgendes. Anstatt benachbarte Nanoobjekte abwechselnd zum Leuchten zu bringen, können Sie Objekte verwenden, die in verschiedenen Farben leuchten. In diesem Fall können Sie mithilfe von Lichtfiltern, die Licht der einen oder anderen Farbe durchlassen, die Position jedes Objekts bestimmen und dann ein einzelnes Bild erstellen. Dies ist dem in Abbildung 5 gezeigten sehr ähnlich, nur dass die Farben für die drei Bilder unterschiedlich sind.
Die letzte Gruppe von Methoden, die es ermöglichen, die Beugungsgrenze zu überwinden und Nanoobjekte zu untersuchen, nutzt die Eigenschaften der leuchtenden Objekte selbst. Es gibt Quellen, die mit speziell ausgewähltem Licht „eingeschaltet“ und „ausgeschaltet“ werden können. Solche Umschaltungen kommen statistisch vor. Mit anderen Worten: Wenn es viele schaltbare Nanoobjekte gibt, können Sie durch Auswahl der Wellenlänge des Lichts und seiner Intensität das „Ausschalten“ nur einiger dieser Objekte erzwingen. Die verbleibenden Objekte leuchten weiterhin und es kann ein Bild von ihnen erhalten werden. Danach müssen Sie alle Quellen „einschalten“ und einige davon wieder „ausschalten“. Die Menge der Quellen, die „eingeschaltet“ bleibt, unterscheidet sich von der Menge, die beim ersten Mal „eingeschaltet“ blieb. Durch mehrmaliges Wiederholen dieses Vorgangs können Sie eine große Anzahl von Bildern erhalten, die sich voneinander unterscheiden. Durch die Analyse eines solchen Satzes ist es möglich, einen großen Teil aller Quellen mit sehr hoher Genauigkeit weit oberhalb der Beugungsgrenze zu lokalisieren. Ein Beispiel für eine auf diese Weise erzielte Superauflösung ist in Abbildung 6 dargestellt.
Die hochauflösende optische Mikroskopie entwickelt sich derzeit rasant. Es ist davon auszugehen, dass dieser Bereich in den kommenden Jahren immer mehr Forscher anziehen wird, und wir hoffen, dass auch die Leser dieses Artikels dazu gehören werden.
Auflösungsgrenze- Dies ist der kleinste Abstand zwischen zwei Punkten eines Objekts, bei dem diese Punkte unterscheidbar sind, d. h. werden im Mikroskop als zwei Punkte wahrgenommen.
Auflösung Unter Mikroskop versteht man die Fähigkeit eines Mikroskops, einzelne Bilder kleiner Details des untersuchten Objekts zu erzeugen. Es ergibt sich aus der Formel:
wobei A die numerische Apertur ist, l die Wellenlänge des Lichts ist; , wobei n der Brechungsindex des Mediums ist, in dem sich das betreffende Objekt befindet, U der Öffnungswinkel.
Um den Aufbau kleinster Lebewesen zu untersuchen, werden Mikroskope mit hoher Vergrößerung und guter Auflösung benötigt. Ein optisches Mikroskop ist auf eine 2000-fache Vergrößerung beschränkt und hat eine Auflösung von maximal 250 nm. Für die Untersuchung feiner Details von Zellen sind diese Werte nicht geeignet.
118. Ultraviolettmikroskop. Eine Möglichkeit zur Reduzierung
Die Grenze der Mikroskopauflösung liegt in der Verwendung von Licht mit kürzerer Wellenlänge. Dabei kommt ein Ultraviolettmikroskop zum Einsatz, bei dem Mikroobjekte in ultravioletten Strahlen untersucht werden. Da das Auge diese Strahlung nicht direkt wahrnimmt, werden Fotoplatten, Leuchtschirme oder elektrooptische Wandler verwendet. Eine weitere Möglichkeit, die Auflösungsgrenze eines Mikroskops zu verringern, besteht darin, den Brechungsindex des Mediums zu erhöhen, in dem sich das Mikroskop befindet. Dazu wird es eingelegt Immersionsflüssigkeit, zum Beispiel Zedernöl.
119. Lumineszenzmikroskopie (Fluoreszenzmikroskopie). basiert auf der Fähigkeit einiger Substanzen, zu lumineszieren, also zu leuchten, wenn sie mit unsichtbarem ultraviolettem oder blauem Licht beleuchtet werden.
Die Lumineszenzfarbe wird im Vergleich zu dem Licht, das sie anregt, zu einem längerwelligen Teil des Spektrums verschoben (Stokes-Regel). Wenn die Lumineszenz durch blaues Licht angeregt wird, kann ihre Farbe von Grün bis Rot reichen; wenn die Lumineszenz durch ultraviolette Strahlung angeregt wird, kann die Lumineszenz in jedem Teil des sichtbaren Spektrums liegen. Diese Eigenschaft der Lumineszenz ermöglicht es, mithilfe spezieller Filter, die aufregendes Licht absorbieren, ein relativ schwaches Lumineszenzlicht zu beobachten.
Da die meisten Mikroorganismen keine eigene Lumineszenz besitzen, werden sie mit Lösungen fluoreszierender Farbstoffe angefärbt. Diese Methode wird zur bakterioskopischen Untersuchung der Erreger bestimmter Infektionen verwendet: Tuberkulose (Auromin), Einschlüsse bestimmter Viren in Zellen usw. Die gleiche Methode kann für die zytochemische Untersuchung lebender und fixierter Mikroorganismen verwendet werden. Bei der Immunfluoreszenzreaktion mithilfe von mit Fluorochromen markierten Antikörpern werden Antigene von Mikroorganismen oder Antikörper im Serum von Patienten nachgewiesen
120. Phasenkontrastmikroskopie. Bei der Mikroskopie ungefärbter Mikroorganismen, die sich von der Umgebung nur im Brechungsindex unterscheiden, ändert sich nicht die Lichtintensität (Amplitude), sondern nur die Phase der durchgelassenen Lichtwellen. Daher kann das Auge diese Veränderungen nicht wahrnehmen und die beobachteten Objekte wirken kontrastarm und transparent. Um solche Objekte zu beobachten, verwenden Sie Phasenkontrastmikroskopie, basiert auf der Umwandlung unsichtbarer Phasenänderungen, die durch ein Objekt verursacht werden, in für das Auge sichtbare Amplitudenänderungen.
Durch den Einsatz dieser Mikroskopiemethode erhöht sich der Kontrast lebender, ungefärbter Mikroorganismen dramatisch und sie erscheinen dunkel auf hellem Hintergrund oder hell auf dunklem Hintergrund.
Phasenkontrastmikroskopie wird auch verwendet, um Gewebekulturzellen zu untersuchen, die Auswirkungen verschiedener Viren auf Zellen zu beobachten usw.
121. Dunkelfeldmikroskopie. Die Dunkelfeldmikroskopie basiert auf der Fähigkeit von Mikroorganismen, Licht stark zu streuen. Für die Dunkelfeldmikroskopie werden herkömmliche Objektive und spezielle Dunkelfeldkondensoren verwendet.
Das Hauptmerkmal von Dunkelfeldkondensoren besteht darin, dass ihr zentraler Teil abgedunkelt ist und direkte Strahlen der Beleuchtung nicht in die Mikroskoplinse gelangen. Das Objekt wird durch schräge Seitenstrahlen beleuchtet und nur durch Partikel im Präparat gestreute Strahlen gelangen in die Mikroskoplinse. Die Dunkelfeldmikroskopie basiert auf dem Tyndall-Effekt. Ein berühmtes Beispiel dafür ist die Erkennung von Staubpartikeln in der Luft, wenn sie von einem schmalen Sonnenlichtstrahl beleuchtet werden.
Bei der Dunkelfeldmikroskopie erscheinen Mikroorganismen hell leuchtend vor einem schwarzen Hintergrund. Mit dieser Methode der Mikroskopie können kleinste Mikroorganismen nachgewiesen werden, deren Größen außerhalb der Auflösung des Mikroskops liegen. Mit der Dunkelfeldmikroskopie können Sie jedoch nur die Umrisse eines Objekts sehen, nicht jedoch die innere Struktur.
122. Wärmestrahlung ist die häufigste Art elektromagnetischer Strahlung in der Natur. Dies wird durch die Energie der thermischen Bewegung von Atomen und Molekülen einer Substanz erreicht. Wärmestrahlung ist allen Körpern bei jeder Temperatur außer dem absoluten Nullpunkt inhärent.
Gesamtkörperemissionsgrad E (auch energetische Leuchtkraft genannt) ist die Energiemenge, die von einer Oberflächeneinheit eines Körpers in 1 s abgegeben wird. Gemessen in J/m 2 s.
Gesamte Strahlungsabsorptionskapazität des Körpers A (Absorptionskoeffizient) ist das Verhältnis der von einem Körper absorbierten Strahlungsenergie zur gesamten auf ihn einfallenden Strahlungsenergie; A ist eine dimensionslose Größe.
123. Absolut schwarzer Körper. Ein imaginärer Körper, der bei jeder Temperatur die gesamte auf ihn einfallende Strahlungsenergie absorbiert, wird als absolut schwarz bezeichnet.
Kirchhoffs Gesetz. Für alle Körper bei einer bestimmten Temperatur ist das Verhältnis des Emissionsgrads E zum Strahlungsabsorptionsvermögen A ein konstanter Wert, der dem Emissionsgrad eines absolut schwarzen Körpers entspricht e bei gleicher Temperatur:
e.
Stefan-Boltzmann-Gesetz. Der Gesamtemissionsgrad eines schwarzen Körpers ist direkt proportional zur vierten Potenz seiner absoluten Temperatur:
e=sT 4 ,
wobei s die Stefan-Boltzmann-Konstante ist.
Weingesetz. Die Wellenlänge, die der maximalen Strahlung eines schwarzen Körpers entspricht, ist umgekehrt proportional zu seiner absoluten Temperatur:
l t ×T = V,
wobei v die Wiensche Konstante ist.
Basierend auf dem Weingesetz optische Pyrometrie– eine Methode zur Bestimmung der Temperatur heißer Körper (Metall in einem Schmelzofen, Gas in einer Wolke einer Atomexplosion, der Oberfläche von Sternen usw.) aus ihrem Strahlungsspektrum. Mit dieser Methode wurde erstmals die Temperatur der Sonnenoberfläche bestimmt.
124 . Infrarotstrahlung. Elektromagnetische Strahlung, die den Spektralbereich zwischen der roten Grenze des sichtbaren Lichts (λ = 0,76 μm) und der kurzwelligen Radiostrahlung (λ = 1 – 2 mm) einnimmt, wird als Infrarot (IR) bezeichnet. Erhitzte Feststoffe und Flüssigkeiten emittieren ein kontinuierliches Infrarotspektrum.
Der therapeutische Einsatz von Infrarotstrahlung beruht auf ihrer thermischen Wirkung. Zur Behandlung kommen spezielle Lampen zum Einsatz.
Infrarotstrahlung dringt etwa 20 mm tief in den Körper ein, wodurch die Oberflächenschichten stärker erhitzt werden. Die therapeutische Wirkung beruht auf dem resultierenden Temperaturgradienten, der die Aktivität des thermoregulatorischen Systems aktiviert. Eine Erhöhung der Blutversorgung des bestrahlten Bereichs führt zu günstigen therapeutischen Konsequenzen.
125. Ultraviolette Strahlung. Elektromagnetische Strahlung,
Der Spektralbereich zwischen dem violetten Rand des sichtbaren Lichts (λ = 400 nm) und dem langwelligen Teil der Röntgenstrahlung (λ = 10 nm) wird als Ultraviolett (UV) bezeichnet.
Bei hohen Temperaturen erhitzte Feststoffe emittieren
eine erhebliche Menge ultravioletter Strahlung. Allerdings das Maximum
Die spektrale Dichte der energetischen Leuchtkraft liegt nach dem Wiener Gesetz bei 7000 K. In der Praxis bedeutet dies, dass die Wärmestrahlung grauer Körper unter normalen Bedingungen nicht als wirksame UV-Strahlungsquelle dienen kann. Die stärkste UV-Strahlungsquelle ist die Sonne, deren Strahlung an der Grenze der Erdatmosphäre zu 9 % ultraviolett ist.
UV-Strahlung ist für den Betrieb von UV-Mikroskopen, Fluoreszenzmikroskopen und für die Fluoreszenzanalyse notwendig. Der Haupteinsatz der UV-Strahlung in der Medizin ist mit ihren spezifischen biologischen Wirkungen verbunden, die durch photochemische Prozesse hervorgerufen werden.
126. Thermographie– Dabei handelt es sich um die Registrierung der Strahlung aus verschiedenen Bereichen
Körperoberfläche zum Zweck der diagnostischen Interpretation. Die Temperatur wird auf zwei Arten bestimmt. In einem Fall kommen Flüssigkristallanzeigen zum Einsatz, deren optische Eigenschaften sehr empfindlich auf kleine Temperaturänderungen reagieren.
Durch die Platzierung dieser Indikatoren am Körper des Patienten ist es möglich, den lokalen Temperaturunterschied durch Änderung ihrer Farbe visuell zu bestimmen.
Eine andere Methode basiert auf der Verwendung Wärmebildkameras, die empfindliche Infrarotstrahlungsdetektoren wie Fotowiderstände verwenden.
127. Physiologische Grundlagen der Thermographie. Physiologische Prozesse im menschlichen Körper gehen mit der Freisetzung von Wärme einher, die durch zirkulierendes Blut und Lymphe übertragen wird. Die Wärmequelle sind biochemische Prozesse, die in einem lebenden Organismus ablaufen. Die erzeugte Wärme wird über das Blut durch den Körper transportiert. Aufgrund seiner hohen Wärmekapazität und Wärmeleitfähigkeit ist zirkulierendes Blut in der Lage, einen intensiven Wärmeaustausch zwischen den zentralen und peripheren Regionen des Körpers durchzuführen. Die Temperatur des Blutes, das durch die Hautgefäße fließt, sinkt um 2-3°.
Die Thermographie basiert auf dem Phänomen einer Zunahme der Intensität der Infrarotstrahlung über pathologischen Herden (aufgrund einer erhöhten Blutversorgung und Stoffwechselprozesse in ihnen) oder einer Abnahme ihrer Intensität in Bereichen mit verminderter regionaler Durchblutung und damit einhergehenden Veränderungen in Geweben und Organen . Dies äußert sich meist durch das Auftreten einer „heißen Zone“. Es gibt zwei Hauptarten der Thermografie: Telethermografie und cholesterische Kontaktthermografie.
128. Telethermographie basiert auf der Umwandlung der Infrarotstrahlung des menschlichen Körpers in ein elektrisches Signal, das auf dem Bildschirm einer Wärmebildkamera visualisiert wird. Empfindliche Fotowiderstände werden als Empfangsgeräte für Infrarotstrahlung in Wärmebildkameras eingesetzt.
Die Wärmebildkamera funktioniert wie folgt. Infrarotstrahlung wird durch ein Linsensystem fokussiert und trifft dann auf einen Fotodetektor, der bei einer Abkühlung auf –196 °C arbeitet. Das Signal des Fotodetektors wird verstärkt und einer digitalen Verarbeitung unterzogen, wobei die empfangenen Informationen anschließend an den Bildschirm eines Farbmonitors übertragen werden.
129. Kontakt-Flüssigkristall-Thermografie beruht auf den optischen Eigenschaften anisotroper cholesterischer Flüssigkristalle, die sich beim Auftragen auf thermisch emittierende Oberflächen durch einen Farbumschlag in Regenbogenfarben bemerkbar machen. Die kältesten Bereiche sind rot, die heißesten blau.
Die Flüssigkristall-Kontaktplatten-Thermografie wird derzeit in verschiedenen Bereichen der Medizin weit verbreitet und erfolgreich eingesetzt, weitaus größere Anwendung finden jedoch Fernmethoden zur Aufzeichnung der Infrarotstrahlung des menschlichen Körpers.
130. Klinische Anwendungen der Thermographie. Die thermografische Diagnostik hat keine äußeren Auswirkungen oder Unannehmlichkeiten für den Patienten und ermöglicht es Ihnen, die Anomalien im thermischen Muster auf der Hautoberfläche des Patienten zu „sehen“, die für viele Krankheiten und körperliche Störungen charakteristisch sind.
Als physiologische, harmlose und nicht-invasive Diagnosemethode findet die Thermographie in der praktischen Medizin Anwendung zur Diagnose einer Vielzahl von Pathologien: Erkrankungen der Brustdrüsen, der Wirbelsäule, der Gelenke, der Schilddrüse, der HNO-Organe, der Blutgefäße, der Leber und der Galle Blase, Darm, Magen, Bauchspeicheldrüse, Nieren, Blase, Prostata. Mit der Thermografie können Sie Veränderungen gleich zu Beginn der Entwicklung des pathologischen Prozesses aufzeichnen, bevor strukturelle Veränderungen im Gewebe auftreten.
131. Rutherfords (Planeten-)Modell des Atoms. Nach diesem Modell sind die gesamte positive Ladung und fast die gesamte Masse (mehr als 99,94 %) eines Atoms im Atomkern konzentriert, dessen Größe im Vergleich zur Größe des Atoms vernachlässigbar klein ist (ca. 10 -13 cm). (10 -8 cm). Elektronen bewegen sich in geschlossenen (elliptischen) Bahnen um den Kern und bilden die Elektronenhülle des Atoms. Die Ladung des Kerns ist betragsmäßig gleich der Gesamtladung der Elektronen.
Nachteile des Rutherford-Modells.
a) Im Rutherford-Modell ist das Atom instabil
Bildung, während die Erfahrung das Gegenteil anzeigt;
b) Nach Rutherford ist das Strahlungsspektrum eines Atoms kontinuierlich, während die Erfahrung von der diskreten Natur der Strahlung spricht.
132. Quantentheorie der Struktur des Atoms nach Bohr. Basierend auf der Idee der Diskretion der Energiezustände des Atoms verbesserte Bohr Rutherfords Atommodell und schuf eine Quantentheorie der Struktur des Atoms. Es basiert auf drei Postulaten.
Elektronen in einem Atom können sich nicht auf irgendwelchen Bahnen bewegen, sondern nur auf Bahnen mit einem ganz bestimmten Radius. In diesen als stationär bezeichneten Bahnen wird der Drehimpuls des Elektrons durch den Ausdruck bestimmt:
Dabei ist m die Masse des Elektrons, v seine Geschwindigkeit, r der Radius der Elektronenbahn und n eine ganze Zahl namens Quantum (n=1,2,3, ...).
Die Bewegung von Elektronen in stationären Umlaufbahnen geht nicht mit einer Strahlung (Absorption) von Energie einher.
Übertragung eines Elektrons von einer stationären Umlaufbahn auf eine andere
begleitet von der Emission (oder Absorption) eines Energiequants.
Der Wert hn dieses Quantums ist gleich der Energiedifferenz W 1 – W 2 der stationären Zustände des Atoms vor und nach der Strahlung (Absorption):
hn=W 1 – W 2.
Diese Beziehung wird als Frequenzbedingung bezeichnet.
133. Arten von Spektren. Es gibt drei Haupttypen von Spektren: einfarbig, linienförmig und gestreift.
Linienspektren
Atome. Die Emission wird durch Übergänge gebundener Elektronen zu niedrigeren Energieniveaus verursacht.
Gestreifte Spektren werden von einzelnen Erregten abgegeben
Moleküle. Strahlung wird sowohl durch elektronische Übergänge in Atomen als auch durch die Schwingungsbewegungen der Atome selbst im Molekül verursacht.
Kontinuierliche Spektren wird von Ansammlungen vieler miteinander interagierender molekularer und atomarer Ionen emittiert.
Die Hauptrolle bei der Strahlung spielt die chaotische Bewegung dieser Teilchen, die durch hohe Temperaturen verursacht wird.
134. Konzept der Spektralanalyse. Jedes chemische Element
emittiert (und absorbiert) Licht mit ganz spezifischen Wellenlängen, die nur für dieses Element gelten. Linienspektren von Elementen werden durch Fotografieren in Spektrographen erhalten, in denen Licht mithilfe eines Beugungsgitters zerlegt wird. Das Linienspektrum eines Elements ist eine Art „Fingerabdruck“, der es Ihnen ermöglicht, dieses Element anhand der Wellenlängen des emittierten (oder absorbierten) Lichts genau zu identifizieren. Spektrografische Untersuchungen gehören zu den leistungsfähigsten chemischen Analysetechniken, die uns zur Verfügung stehen.
Qualitative Spektralanalyse– Dies ist ein Vergleich der erhaltenen Spektren mit den tabellierten Spektren, um die Zusammensetzung des Stoffes zu bestimmen.
Quantitative Spektralanalyse erfolgt durch Photometrie (Bestimmung der Intensität) von Spektrallinien: Die Helligkeit der Linien ist proportional zur Menge eines bestimmten Elements.
Spektroskopkalibrierung. Um mit einem Spektroskop die Wellenlängen des untersuchten Spektrums bestimmen zu können, muss das Spektroskop kalibriert werden, d. h. Stellen Sie die Beziehung zwischen den Wellenlängen von Spektrallinien und den Unterteilungen der Spektroskopskala her, bei denen sie sichtbar sind.
135. Hauptmerkmale und Anwendungsbereiche der Spektralanalyse. Mithilfe der Spektralanalyse können Sie sowohl die atomare als auch die molekulare Zusammensetzung eines Stoffes bestimmen. Die Spektralanalyse ermöglicht die qualitative Entdeckung einzelner Bestandteile der analysierten Probe und die quantitative Bestimmung ihrer Konzentration. Stoffe mit sehr ähnlichen chemischen Eigenschaften, die mit chemischen Methoden nur schwer oder gar nicht analysiert werden können, lassen sich einfach spektral bestimmen.
Empfindlichkeit Die Spektralanalyse ist normalerweise sehr hoch. Die direkte Analyse erreicht eine Sensitivität von 10 -3 - 10 -6 %. Geschwindigkeit Die Spektralanalyse übertrifft in der Regel die Analysegeschwindigkeit anderer Methoden deutlich.
136. Spektralanalyse in der Biologie. Die spektroskopische Methode zur Messung der optischen Aktivität von Substanzen wird häufig zur Bestimmung der Struktur biologischer Objekte eingesetzt. Bei der Untersuchung biologischer Moleküle werden deren Absorptionsspektren und Fluoreszenz gemessen. Farbstoffe, die unter Laseranregung fluoreszieren, werden zur Bestimmung des Wasserstoffindex und der Ionenstärke in Zellen sowie zur Untersuchung bestimmter Bereiche in Proteinen eingesetzt. Mittels resonanter Raman-Streuung wird die Struktur von Zellen untersucht und die Konformation von Protein- und DNA-Molekülen bestimmt. Die Spektroskopie spielte eine wichtige Rolle bei der Erforschung der Photosynthese und der Biochemie des Sehens.
137. Spektralanalyse in der Medizin. Im menschlichen Körper gibt es mehr als achtzig chemische Elemente. Ihr Zusammenspiel und ihre gegenseitige Beeinflussung gewährleisten die Prozesse Wachstum, Entwicklung, Verdauung, Atmung, Immunität, Hämatopoese, Gedächtnis, Befruchtung usw.
Für die Diagnose von Mikro- und Makroelementen sowie deren quantitativem Ungleichgewicht sind Haare und Nägel das fruchtbarste Material. Jedes Haar speichert über den gesamten Zeitraum seines Wachstums integrale Informationen über den Mineralstoffwechsel des gesamten Organismus. Die Spektralanalyse liefert vollständige Informationen über den Mineralstoffhaushalt über einen langen Zeitraum. Einige toxische Substanzen können nur mit dieser Methode nachgewiesen werden. Zum Vergleich: Herkömmliche Methoden erlauben es, mit einer Blutuntersuchung den Anteil von weniger als zehn Mikroelementen zum Zeitpunkt der Untersuchung zu bestimmen.
Die Ergebnisse der Spektralanalyse helfen dem Arzt bei der Diagnose und Suche nach der Ursache von Krankheiten sowie bei der Identifizierung versteckter Krankheiten und deren Veranlagung. ermöglichen es Ihnen, Medikamente genauer zu verschreiben und individuelle Schemata zur Wiederherstellung des Mineralstoffgleichgewichts zu entwickeln.
Die Bedeutung spektroskopischer Methoden in der Pharmakologie und Toxikologie kann kaum überschätzt werden. Sie ermöglichen insbesondere die Analyse von Proben pharmakologischer Arzneimittel während ihrer Validierung sowie die Identifizierung gefälschter Arzneimittel. In der Toxikologie ermöglichte die Ultraviolett- und Infrarotspektroskopie die Identifizierung vieler Alkaloide aus Stas-Extrakten.
138. Lumineszenz Als übermäßige Strahlung eines Körpers bei einer bestimmten Temperatur bezeichnet man eine Dauer, die die Periode der ausgesendeten Lichtwellen deutlich überschreitet.
Photolumineszenz. Die durch Photonen verursachte Lumineszenz wird Photolumineszenz genannt.
Chemilumineszenz. Lumineszenz, die chemische Reaktionen begleitet, wird Chemilumineszenz genannt.
139. Lumineszenzanalyse basierend auf der Beobachtung der Lumineszenz von Objekten zum Zweck ihrer Untersuchung; werden verwendet, um das Anfangsstadium des Verderbens von Lebensmitteln zu erkennen, pharmakologische Arzneimittel zu sortieren und bestimmte Krankheiten zu diagnostizieren.
140. Photoelektrischer Effekt wird als Pullout-Phänomen bezeichnet
Elektronen aus einer Substanz unter dem Einfluss von auf sie einfallendem Licht.
Bei externer photoelektrischer Effekt Ein Elektron verlässt die Oberfläche einer Substanz.
Bei interner photoelektrischer Effekt Das Elektron wird aus seinen Bindungen mit dem Atom gelöst, verbleibt aber im Inneren der Substanz.
Einsteins Gleichung:
Dabei ist hn die Energie des Photons, n seine Frequenz, A die Austrittsarbeit des Elektrons, die kinetische Energie des emittierten Elektrons und v seine Geschwindigkeit.
Gesetze des photoelektrischen Effekts:
Die Anzahl der pro Zeiteinheit von der Metalloberfläche emittierten Photoelektronen ist proportional zum auf das Metall einfallenden Lichtfluss.
Maximale anfängliche kinetische Energie von Photoelektronen
wird durch die Frequenz des einfallenden Lichts bestimmt und ist nicht von dessen Intensität abhängig.
Für jedes Metall gibt es eine rote Grenze des photoelektrischen Effekts, d. h. die maximale Wellenlänge l 0, bei der der photoelektrische Effekt noch möglich ist.
Der externe photoelektrische Effekt wird in Photomultiplier-Röhren (PMTs) und elektronenoptischen Wandlern (EOCs) genutzt. PMTs werden zur Messung von Lichtflüssen geringer Intensität verwendet. Mit ihrer Hilfe kann schwache Biolumineszenz nachgewiesen werden. Bildverstärkerröhren werden in der Medizin eingesetzt, um die Helligkeit von Röntgenbildern zu erhöhen; in der Thermografie – um die Infrarotstrahlung des Körpers in sichtbare Strahlung umzuwandeln. Darüber hinaus werden Fotozellen in der U-Bahn beim Passieren von Drehkreuzen, in modernen Hotels, Flughäfen usw. eingesetzt. zum automatischen Öffnen und Schließen von Türen, zum automatischen Ein- und Ausschalten der Straßenbeleuchtung, zur Bestimmung der Beleuchtungsstärke (Luxmeter) usw.
141. Röntgenstrahlung ist elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge von 0,01 bis 0,000001 Mikrometer. Dadurch leuchtet der mit Phosphor beschichtete Bildschirm und die Emulsion wird schwarz, sodass er für die Fotografie geeignet ist.
Röntgenstrahlen entstehen, wenn Elektronen beim Auftreffen auf die Anode einer Röntgenröhre plötzlich anhalten. Zunächst werden die von der Kathode emittierten Elektronen durch eine beschleunigende Potentialdifferenz auf Geschwindigkeiten in der Größenordnung von 100.000 km/s beschleunigt. Diese Strahlung, Bremsstrahlung genannt, hat ein kontinuierliches Spektrum.
Die Intensität der Röntgenstrahlung wird durch die empirische Formel bestimmt:
Dabei ist I die Stromstärke in der Röhre, U die Spannung, Z die Seriennummer des Atoms der Antikathodensubstanz und k die Konstante.
Röntgenstrahlung, die durch die Abbremsung von Elektronen entsteht, wird „Bremsstrahlung“ genannt.
Kurzwellige Röntgenstrahlen sind im Allgemeinen durchdringender als langwellige Röntgenstrahlen und werden aufgerufen hart, und Langwelle – weich.
Bei hohen Spannungen in der Röntgenröhre, zusammen mit
Röntgenstrahlen mit einem kontinuierlichen Spektrum erzeugen Röntgenstrahlen mit einem Linienspektrum; Letzteres ist dem kontinuierlichen Spektrum überlagert. Diese Strahlung wird als charakteristisch bezeichnet, da jede Substanz ihr eigenes, charakteristisches Linien-Röntgenspektrum hat (ein kontinuierliches Spektrum der Anodensubstanz und nur durch die Spannung an der Röntgenröhre bestimmt).
142. Eigenschaften der Röntgenstrahlung. Röntgenstrahlen haben alle Eigenschaften, die Lichtstrahlen charakterisieren:
1) weichen in elektrischen und magnetischen Feldern nicht ab und tragen daher keine elektrische Ladung;
2) einen fotografischen Effekt haben;
3) eine Gasionisierung verursachen;
4) fähig, Lumineszenz zu verursachen;
5) kann gebrochen und reflektiert werden, polarisiert sein und das Phänomen der Interferenz und Beugung hervorrufen.
143. Moseleys Gesetz. Da Atome verschiedener Stoffe je nach Struktur unterschiedliche Energieniveaus aufweisen, hängen die Spektren der charakteristischen Strahlung von der Struktur der Atome des Anodenstoffes ab. Die charakteristischen Spektren verschieben sich mit zunehmender Kernladung zu höheren Frequenzen. Dieses Muster ist als Moseley-Gesetz bekannt:
Dabei ist n die Frequenz der Spektrallinie, Z die Seriennummer des emittierenden Elements und A und B Konstanten.
144. Wechselwirkung von Röntgenstrahlen mit Materie. Abhängig vom Verhältnis von Photonenenergie e und Ionisierungsenergie A laufen drei Hauptprozesse ab.
Kohärente (klassische) Streuung. Die Streuung langwelliger Röntgenstrahlung erfolgt hauptsächlich ohne Änderung der Wellenlänge und wird als kohärent bezeichnet . Es tritt auf, wenn die Photonenenergie kleiner als die Ionisierungsenergie ist: hn<А. Так как в этом случае энергия фотона рентгеновского излучения и атома не изменяются, то когерентное рассеяние само по себе не вызывает биологического действия.
Inkohärente Streuung (Compton-Effekt). Im Jahr 1922 A.Kh. Compton beobachtete die Streuung harter Röntgenstrahlen und entdeckte eine Abnahme der Durchdringungskraft des gestreuten Strahls im Vergleich zum einfallenden Strahl. Dies bedeutete, dass die Wellenlänge der gestreuten Röntgenstrahlung länger war als die der einfallenden Röntgenstrahlung. Die Streuung von Röntgenstrahlen mit einer Änderung der Wellenlänge wird als inkohärent bezeichnet, und das Phänomen selbst wird als Compton-Effekt bezeichnet.
Fotoeffekt. Beim photoelektrischen Effekt werden Röntgenstrahlen von einem Atom absorbiert, wodurch ein Elektron ausgestoßen und das Atom ionisiert wird (Photoionisierung). Reicht die Photonenenergie zur Ionisierung nicht aus, kann sich der photoelektrische Effekt in der Anregung von Atomen ohne Emission von Elektronen manifestieren.
Ionisierende Wirkung Röntgenstrahlung äußert sich in einer Erhöhung der elektrischen Leitfähigkeit unter dem Einfluss von Röntgenstrahlen. Diese Eigenschaft wird in der Dosimetrie genutzt, um die Wirkung dieser Strahlungsart zu quantifizieren.
145. Röntgenlumineszenz bezeichnet das Leuchten einer Reihe von Stoffen unter Röntgenbestrahlung. Dieses Leuchten von Platin-Synoxid-Barium ermöglichte es Röntgen, die Strahlen zu entdecken. Dieses Phänomen wird genutzt, um spezielle Leuchtschirme zur visuellen Beobachtung von Röntgenstrahlen zu schaffen, manchmal um die Wirkung von Röntgenstrahlen auf einer Fotoplatte zu verstärken, wodurch diese Strahlen aufgezeichnet werden können.
146. Röntgenabsorption beschrieben durch Bouguers Gesetz:
F = F 0 e - m x,
wobei m der lineare Dämpfungskoeffizient ist,
x – Dicke der Substanzschicht,
F 0 – Intensität der einfallenden Strahlung,
F ist die Intensität der durchgelassenen Strahlung.
147. Einfluss von Röntgenstrahlung auf den Körper. Obwohl die Strahlenbelastung bei Röntgenuntersuchungen gering ist, können sie zu Veränderungen im Chromosomenapparat von Zellen – Strahlenmutationen – führen. Deshalb müssen Röntgenuntersuchungen geregelt werden.
148. Röntgendiagnostik. Die Röntgendiagnostik basiert auf der selektiven Absorption von Röntgenstrahlung durch Gewebe und Organe.
149. Röntgen. Bei der Durchleuchtung wird ein Bild des durchleuchteten Objekts auf einem Durchleuchtungsschirm aufgenommen. Die Technik ist einfach und wirtschaftlich; sie ermöglicht die Beobachtung der Bewegung von Organen und der Bewegung von Kontrastmaterial in ihnen. Allerdings hat es auch Nachteile: Danach bleibt kein Dokument mehr übrig, das in Zukunft besprochen oder in Betracht gezogen werden könnte. Kleine Bilddetails sind auf dem Bildschirm schwer zu erkennen. Die Durchleuchtung ist für den Patienten und den Arzt mit einer weitaus höheren Strahlenbelastung verbunden als die Radiographie.
150. Radiographie. Bei der Radiographie wird ein Röntgenstrahl auf den zu untersuchenden Körperteil gerichtet. Die den menschlichen Körper durchdringende Strahlung trifft auf den Film, auf dem nach der Bearbeitung ein Bild entsteht.
151. Elektroradiographie. Dabei trifft ein durch den Patienten hindurchtretender Röntgenstrahl auf eine mit statischer Elektrizität aufgeladene Selenplatte. In diesem Fall ändert die Platte ihr elektrisches Potenzial und es entsteht ein latentes Bild elektrischer Ladungen auf ihr.
Der Hauptvorteil der Methode ist die Möglichkeit, schnell eine große Anzahl hochwertiger Bilder zu erhalten, ohne Röntgenfilme mit teuren Silberverbindungen zu verbrauchen und ohne den „nassen“ fotografischen Prozess.
152. Fluorographie. Sein Prinzip besteht darin, ein Röntgenbild von einem Bildschirm auf einen kleinformatigen Rollfilm zu fotografieren. Es wird für Massenbefragungen der Bevölkerung eingesetzt. Die Vorteile der Methode sind Schnelligkeit und Effizienz.
153. Künstlicher Kontrast von Organen. Die Methode basiert auf
Einführung harmloser Substanzen in den Körper, die absorbiert werden
Röntgenstrahlung ist viel stärker oder umgekehrt viel schwächer als das untersuchte Organ. Beispielsweise wird dem Patienten die Einnahme einer wässrigen Suspension von Bariumsulfat empfohlen. In diesem Fall erscheint auf dem Bild ein Schatten einer Kontrastmittelmasse, die sich in der Magenhöhle befindet. Anhand der Position, Form, Größe und Umrisse des Schattens kann man die Lage des Magens, die Form und Größe seiner Höhle beurteilen.
Jod wird zur Kontrastierung der Schilddrüse eingesetzt. Zu diesem Zweck verwendete Gase sind Sauerstoff, Lachgas und Kohlendioxid. In den Blutkreislauf können nur Lachgas und Kohlendioxid injiziert werden, da sie im Gegensatz zu Sauerstoff keine Gasembolie verursachen.
154. Röntgenbildverstärker. Die Helligkeit des Leuchtens, das Röntgenstrahlung in sichtbares Licht des Fluoreszenzschirms umwandelt, den der Radiologe bei der Durchleuchtung verwendet, beträgt Hundertstel Candela pro Quadratmeter (Candela – Kerze). Dies entspricht in etwa der Helligkeit des Mondlichts in einer wolkenlosen Nacht. Bei einer solchen Beleuchtung arbeitet das menschliche Auge im Dämmerungsmodus, in dem kleine Details und schwache Kontrastunterschiede äußerst schlecht unterschieden werden können.
Es ist unmöglich, die Helligkeit des Bildschirms zu erhöhen, da die Strahlendosis des Patienten proportional zunimmt, was ohnehin nicht ungefährlich ist.
Die Möglichkeit, dieses Hindernis zu beseitigen, bieten Röntgenbildverstärker (XI), die in der Lage sind, die Helligkeit von Bildern tausendfach zu erhöhen, indem sie Elektronen mithilfe eines externen elektrischen Felds wiederholt beschleunigen. Neben der Erhöhung der Helligkeit können URIs die Strahlendosis bei der Forschung deutlich reduzieren.
155. Angiographie– Methode der Kontrastuntersuchung von Blutgefäßen
ein System, bei dem ein Radiologe unter visueller Röntgenkontrolle mittels URI und Fernsehen einen dünnen elastischen Schlauch – einen Katheter – in eine Vene einführt und ihn zusammen mit dem Blutfluss in nahezu jeden Bereich des Körpers leitet, sogar in die Vene das Herz. Dann wird im richtigen Moment eine röntgendichte Flüssigkeit durch den Katheter injiziert und gleichzeitig eine Reihe von Bildern aufgenommen, die mit hoher Geschwindigkeit aufeinanderfolgen.
156. Digitale Methode der Informationsverarbeitung. Elektrische Signale sind die bequemste Form für die anschließende Bildverarbeitung. Manchmal ist es von Vorteil, eine Linie in einem Bild hervorzuheben, eine Kontur hervorzuheben oder manchmal eine Textur hervorzuheben. Die Verarbeitung kann sowohl elektronisch-analog als auch digital erfolgen. Zur digitalen Verarbeitung werden analoge Signale mithilfe von Analog-Digital-Wandlern (ADCs) in diskrete Form umgewandelt und in dieser Form an den Computer gesendet.
Das auf dem Durchleuchtungsbildschirm erhaltene Lichtbild wird durch einen elektronenoptischen Wandler (EOC) verstärkt und tritt durch das optische System am Eingang der TT-Fernsehröhre ein und wird in eine Folge elektrischer Signale umgewandelt. Mit dem ADC werden Abtastung und Quantisierung durchgeführt und anschließend im digitalen Arbeitsspeicher (RAM) aufgezeichnet und Bildsignale gemäß festgelegten Programmen verarbeitet. Das umgewandelte Bild wird mithilfe eines DAC-Digital-Analog-Wandlers erneut in analoge Form umgewandelt und auf dem Bildschirm des Videosteuergeräts VKU auf einem Graustufendisplay angezeigt.
157. Farbkodierung von Schwarzweißbildern. Die meisten introskopischen Bilder sind monochrom, also ohne Farbe. Aber das normale menschliche Sehen ist Farbe. Um die Kräfte des Auges voll auszunutzen, ist es in manchen Fällen sinnvoll, unsere introskopischen Bilder im letzten Stadium ihrer Transformation künstlich einzufärben.
Wenn das Auge Farbbilder wahrnimmt,
zusätzliche Bildfunktionen, die die Analyse erleichtern. Das
Farbton, Farbsättigung, Farbkontrast. In Farbe erhöht sich die Sichtbarkeit von Details und die Kontrastempfindlichkeit des Auges um ein Vielfaches.
158. Röntgentherapie. Röntgenstrahlung wird zur Strahlentherapie bei der Behandlung einer Reihe von Krankheiten eingesetzt. Die Indikationen und Taktiken der Strahlentherapie ähneln in vielerlei Hinsicht den Methoden der Gammatherapie.
159. Tomographie. Das Bild eines für den Arzt interessanten Organs oder einer pathologischen Formation wird mit Schatten benachbarter Organe und Gewebe überlagert, die sich entlang des Röntgenstrahls befinden.
Die Essenz der Tomographie liegt im Aufnahmeprozess
Die Röntgenröhre bewegt sich relativ zum Patienten und liefert scharfe Bilder nur der Details, die in einer bestimmten Tiefe liegen. Somit ist die Tomographie eine schichtweise Röntgenuntersuchung.
160. Laserstrahlung– ist ein kohärentes, identisch gerichtetes
Strahlung vieler Atome, die einen schmalen Strahl monochromatischen Lichts erzeugt.
Damit ein Laser seine Arbeit aufnehmen kann, ist es notwendig, eine große Anzahl von Atomen seiner Arbeitssubstanz in einen angeregten (metastabilen) Zustand zu überführen. Dazu wird elektromagnetische Energie aus einer speziellen Quelle auf den Arbeitsstoff übertragen (Pumpverfahren). Danach beginnen in der Arbeitssubstanz nahezu gleichzeitige erzwungene Übergänge aller angeregten Atome in den Normalzustand mit der Emission eines starken Photonenstrahls.
161. Anwendung von Lasern in der Medizin.Hochenergielaser
Wird als Laserskalpell in der Onkologie verwendet. In diesem Fall wird eine rationelle Entfernung des Tumors mit minimaler Schädigung des umliegenden Gewebes erreicht und die Operation kann in der Nähe von Hirnstrukturen mit großer funktioneller Bedeutung durchgeführt werden.
Der Blutverlust bei der Verwendung eines Laserstrahls ist viel geringer, die Wunde wird vollständig sterilisiert und die Schwellung in der postoperativen Phase ist minimal.
Besonders wirksam sind Laser in der Augenmikrochirurgie. Es ermöglicht die Behandlung von Glaukomen, indem es mit seinem Strahl mikroskopisch kleine Löcher „durchsticht“, damit intraokulare Flüssigkeit abfließen kann. Der Laser wird zur nicht-chirurgischen Behandlung von Netzhautablösungen eingesetzt.
Niedrigenergetische Laserstrahlung wirkt entzündungshemmend, schmerzstillend, verändert den Gefäßtonus, verbessert Stoffwechselprozesse usw.; Es wird in der Spezialtherapie in verschiedenen Bereichen der Medizin eingesetzt.
162. Wirkung des Lasers auf den Körper. Die Wirkung von Laserstrahlung auf den Körper ähnelt in vielerlei Hinsicht der Wirkung elektromagnetischer Strahlung im sichtbaren und infraroten Bereich. Auf molekularer Ebene führt ein solcher Effekt zu einer Änderung der Energieniveaus von Molekülen lebender Materie, ihrer stereochemischen Umlagerung und der Koagulation von Proteinstrukturen. Die physiologischen Wirkungen der Laserbelichtung sind mit dem photodynamischen Effekt der Photoreaktivierung, dem Effekt der Stimulierung oder Hemmung biologischer Prozesse, Veränderungen im Funktionszustand beider einzelner Systeme und des Körpers als Ganzes verbunden.
163. Einsatz von Lasern in der biomedizinischen Forschung. Einer der Hauptbereiche der Laserdiagnostik ist Spektroskopie kondensierter Materie, das die Analyse biologischer Gewebe und deren Visualisierung auf zellulärer, subzellulärer und molekularer Ebene ermöglicht.
Bildqualität bestimmt Auflösung des Mikroskops, d.h. der Mindestabstand, bei dem die Optik eines Mikroskops zwei eng beieinander liegende Punkte getrennt unterscheiden kann. Die Auflösung hängt von der numerischen Apertur des Objektivs, des Kondensors und der Wellenlänge des Lichts ab, mit dem die Probe beleuchtet wird. Die numerische Apertur (Öffnung) hängt von der Winkelöffnung und dem Brechungsindex des Mediums ab, das sich zwischen der Frontlinse des Objektivs und Kondensors und der Probe befindet.
Winkelöffnung der Linse- Dies ist der maximale Winkel (AOB), in dem Strahlen, die das Präparat durchdringen, in die Linse gelangen können. Numerische Apertur des Objektivs gleich dem Produkt aus dem Sinus der halben Winkelöffnung und dem Brechungsindex des Mediums, das sich zwischen dem Glasträger und der Frontlinse der Objektivlinse befindet. N / A. = n sinα wobei N.A. - numerische Apertur; n ist der Brechungsindex des Mediums zwischen Probe und Linse; sinα ist der Sinus des Winkels α, der dem halben Winkel AOB im Diagramm entspricht.
Daher darf die Apertur trockener Systeme (zwischen der vorderen Objektivlinse und der Luftaufbereitung) nicht größer als 1 sein (normalerweise nicht mehr als 0,95). Das zwischen der Probe und dem Objektiv platzierte Medium wird Immersionsflüssigkeit oder Immersion genannt, und ein Objektiv, das für die Arbeit mit Immersionsflüssigkeit ausgelegt ist, wird Immersion genannt. Dank der Immersion mit einem höheren Brechungsindex als Luft ist es möglich, die numerische Apertur des Objektivs und damit die Auflösung zu erhöhen.
Die numerische Apertur von Objektiven ist immer auf der Fassung eingraviert.
Die Auflösung des Mikroskops hängt auch von der Apertur des Kondensors ab. Wenn wir davon ausgehen, dass die Apertur des Kondensors gleich der Apertur des Objektivs ist, dann hat die Auflösungsformel die Form R=λ/2NA, wobei R die Auflösungsgrenze ist; λ – Wellenlänge; N.A. – numerische Apertur. Aus dieser Formel geht klar hervor, dass bei Beobachtung im sichtbaren Licht (grüner Teil des Spektrums – λ = 550 nm) die Auflösung (Auflösungsgrenze) nicht > 0,2 µm sein kann
Der Einfluss der numerischen Apertur des Mikroskopobjektivs auf die Bildqualität
Möglichkeiten zur Erhöhung der optischen Auflösung
Auswahl eines großen Lichtkegelwinkels, sowohl von der Linsenseite als auch von der Lichtquellenseite. Dadurch ist es möglich, mehr gebrochene Lichtstrahlen von sehr dünnen Strukturen in der Linse zu sammeln. Daher besteht die erste Möglichkeit zur Erhöhung der Auflösung darin, einen Kondensor zu verwenden, dessen numerische Apertur mit der numerischen Apertur des Objektivs übereinstimmt.
Die zweite Methode besteht darin, Immersionsflüssigkeit zwischen der vorderen Objektivlinse und dem Deckglas zu verwenden. Dadurch beeinflussen wir den Brechungsindex des Mediums n, beschrieben in der ersten Formel. Der für Immersionsflüssigkeiten empfohlene optimale Wert beträgt 1,51.
Immersionsflüssigkeiten
Immersionsflüssigkeiten sind notwendig, um die numerische Apertur und damit die Auflösung von Immersionsobjektiven zu erhöhen, die speziell für die Arbeit mit diesen Flüssigkeiten entwickelt und entsprechend gekennzeichnet sind. Zwischen Objektiv und Probe befindliche Immersionsflüssigkeiten haben einen höheren Brechungsindex als Luft. Daher werden von kleinsten Details des Objekts abgelenkte Lichtstrahlen beim Verlassen des Präparats nicht gestreut und gelangen nicht in das Objektiv, was zu einer Erhöhung der Auflösung führt.
Es gibt Wasserimmersionslinsen (gekennzeichnet mit einem weißen Ring), Ölimmersionslinsen (schwarzer Ring), Glycerinimmersionslinsen (gelber Ring) und Monobromnaphthalin-Immersionslinsen (roter Ring). In der Lichtmikroskopie biologischer Präparate werden Wasser- und Ölimmersionsobjektive verwendet. Spezielle Quarz-Glycerin-Immersionsobjektive übertragen kurzwellige ultraviolette Strahlung und sind für die Ultraviolettmikroskopie (nicht zu verwechseln mit Fluoreszenzmikroskopie) konzipiert (d. h. für die Untersuchung biologischer Objekte, die ultraviolette Strahlen selektiv absorbieren). Monobromierte Naphthalin-Immersionsobjektive werden in der Mikroskopie biologischer Objekte nicht verwendet.
Als Immersionsflüssigkeit für eine Wasserimmersionslinse wird destilliertes Wasser verwendet, und als Immersionsflüssigkeit für eine Ölimmersionslinse wird natürliches (Zedernholz) oder synthetisches Öl mit einem bestimmten Brechungsindex verwendet.
Im Gegensatz zu anderen Immersionsflüssigkeiten Ölimmersion ist homogen, weil es einen Brechungsindex hat, der dem Brechungsindex von Glas entspricht oder diesem sehr nahe kommt. Typischerweise wird dieser Brechungsindex (n) für eine bestimmte Spektrallinie und eine bestimmte Temperatur berechnet und auf der Ölflasche angegeben. Beispielsweise beträgt der Brechungsindex von Immersionsöl für das Arbeiten mit Deckglas für die Spektrallinie D im Natriumspektrum bei einer Temperatur = 20°C 1,515 (nD 20 = 1,515), für das Arbeiten ohne Deckglas (nD 20 = 1,520). ).
Um mit apochromatischen Linsen zu arbeiten, wird auch die Dispersion normalisiert, also der Unterschied in den Brechungsindizes für verschiedene Linien des Spektrums.
Die Verwendung von synthetischem Immersionsöl ist vorzuziehen, da seine Parameter genauer standardisiert sind und es im Gegensatz zu Zedernöl nicht auf der Oberfläche der Frontlinse des Objektivs austrocknet.
In Anbetracht des oben Gesagten sollten Sie auf keinen Fall Ersatzstoffe für Immersionsöl und insbesondere Vaseline verwenden. Um die Apertur des Kondensators zu vergrößern, wird bei einigen Mikroskopiemethoden eine Immersionsflüssigkeit (normalerweise destilliertes Wasser) zwischen den Kondensator und die Probe gegeben.
Es ist technisch möglich, optische Mikroskope zu bauen, deren Linsen und Okulare eine Gesamtvergrößerung von 1500-2000 oder mehr bieten. Dies ist jedoch unpraktisch, da die Fähigkeit, kleine Details eines Objekts zu unterscheiden, durch Beugungsphänomene eingeschränkt wird. Dadurch verliert das Bild kleinster Details eines Objekts an Schärfe, es kann zu einer Verletzung der geometrischen Ähnlichkeit von Bild und Objekt kommen, benachbarte Punkte verschmelzen zu einem und das Bild verschwindet möglicherweise vollständig. Daher gibt es in der Optik folgende Konzepte, die die Qualität eines Mikroskops charakterisieren:
Mikroskopauflösung- die Eigenschaft eines Mikroskops, ein separates Bild kleiner Details des betrachteten Objekts zu liefern.
Auflösungsgrenze- Dies ist der kleinste Abstand zwischen zwei Punkten, die separat im Mikroskop sichtbar sind.
Je niedriger die Auflösungsgrenze, desto höher ist die Auflösung des Mikroskops!
Die Auflösungsgrenze bestimmt die kleinste Größe von Details, die mit einem Mikroskop in einer Probe unterschieden werden können.
Die Theorie des Auflösungsvermögens des Mikroskops wurde vom Direktor des K. Zeiss-Werks in Jena, Professor für Optik E. Abbe (1840-1905), entwickelt. Als einfache mikroskopische Probe nahm er ein Beugungsgitter (Abb. 2), untersuchte den Mechanismus der Bildentstehung im Mikroskop und zeigte Folgendes.
Lassen Sie uns das Konzept vorstellen Öffnungswinkel- Dies ist der Winkel zwischen den Außenstrahlen eines kegelförmigen Lichtstrahls, der von der Mitte des Objekts in die Linse gelangt (Abb. 3, A). Um ein Bild zu erzeugen, also ein Objekt aufzulösen, reicht es aus, dass das Objektiv Strahlen empfängt, die auf mindestens einer Seite nur Maxima nullter und erster Ordnung bilden (Abb. 2 und 3, B). Die Beteiligung von Strahlen aus einer größeren Anzahl von Maxima an der Bildentstehung erhöht die Qualität des Bildes und seinen Kontrast. Daher müssen die Strahlen, die diese Maxima bilden, innerhalb des Öffnungswinkels der Linse liegen.
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A B C D)
1 - Frontlinse, 2 - Linse
Wenn das Objekt also ein Beugungsgitter mit einer Periode ist D und das Licht fällt normal darauf (Abb. 2 und 3, B), dann müssen die Strahlen, die auf beiden Seiten Maxima nullter und erster Ordnung bilden, notwendigerweise an der Bildbildung beteiligt sein, und der Winkel j 1 ist der Ablenkwinkel der Strahlen, die jeweils das Maximum erster Ordnung bilden im Extremfall gleich dem Winkel sein U/2.
Nehmen wir einen Verband mit einer kleineren Periode D’, dann ist der Winkel j’ 1 größer als der Winkel U/2 und das Bild wird nicht angezeigt. Damit ist die Gitterperiode gemeint D kann als Auflösungsgrenze des Mikroskops angesehen werden Z. Dann schreiben wir unter Verwendung der Beugungsgitterformel für k=1:
Ersetzen D An Z, und j 1 auf U/2, wir bekommen
. (6)
Bei der Mikroskopie treffen Lichtstrahlen in verschiedenen Winkeln auf ein Objekt. Bei schrägem Strahleneinfall (Abb. 3, G) Die Auflösungsgrenze nimmt ab, da nur Strahlen, die auf einer Seite Maxima nullter und erster Ordnung bilden, an der Bilderzeugung beteiligt sind und der Winkel j 1 gleich dem Öffnungswinkel ist U. Berechnungen zeigen, dass die Formel für die Auflösungsgrenze in diesem Fall wie folgt aussieht:
. (7)
Wenn der Raum zwischen Objekt und Linse mit einem Immersionsmedium mit einem Brechungsindex gefüllt ist N, die größer ist als der Brechungsindex von Luft, dann die Wellenlänge des Lichts l N= l ¤ N. Wenn wir diesen Ausdruck in die Formel für die Auflösungsgrenze (7) einsetzen, erhalten wir:
, oder 
. (8)
Somit bestimmt Formel (7) die Auflösungsgrenze für ein Mikroskop mit Trockenobjektiv und Formel (8) für ein Mikroskop mit Immersionsobjektiv. Werte sin 0,5 U Und n× sin0,5 U In diesen Formeln wird die numerische Apertur des Objektivs genannt und mit dem Buchstaben bezeichnet A. Unter Berücksichtigung dessen lautet die Formel für die Auflösungsgrenze eines Mikroskops in allgemeiner Form wie folgt:
Wie aus den Formeln (8) und (9) ersichtlich ist, hängt die Auflösung des Mikroskops von der Wellenlänge des Lichts, dem Öffnungswinkel, dem Brechungsindex des Mediums zwischen Linse und Objekt und dem Einfallswinkel der Lichtstrahlen ab vom Objekt abhängig, hängt aber nicht von den Parametern des Okulars ab. Das Okular liefert keine zusätzlichen Informationen über die Struktur des Objekts, verbessert die Bildqualität nicht, es vergrößert lediglich das Zwischenbild.
Die Auflösung eines Mikroskops kann durch Immersion und Reduzierung der Lichtwellenlänge erhöht werden. Die Erhöhung der Auflösung beim Einsatz von Immersion lässt sich wie folgt erklären. Befindet sich zwischen Linse und Objekt Luft (trockene Linse), dann ändert der Lichtstrahl beim Übergang vom Deckglas in Luft, ein Medium mit niedrigerem Brechungsindex, durch Brechung deutlich seine Richtung, es strahlt also weniger Betreten Sie das Objektiv. Bei Verwendung eines Immersionsmediums, dessen Brechungsindex etwa dem Brechungsindex von Glas entspricht, ist keine Änderung des Strahlengangs im Medium zu beobachten und es gelangen mehr Strahlen in die Linse.
Als Immersionsflüssigkeit wird Wasser verwendet ( N=1,33), Zedernöl ( N=1,515) usw. Wenn der maximale Öffnungswinkel für moderne Objektive 140 0 erreicht, dann für ein Trockenobjektiv A=0,94 und für ein Objektiv mit Ölimmersion A=1,43. Wenn wir bei der Berechnung die Lichtwellenlänge l = 555 nm verwenden, für die das Auge am empfindlichsten ist, beträgt die Auflösungsgrenze einer trockenen Linse 0,30 µm und bei Ölimmersion 0,19 µm. Der numerische Blendenwert ist auf dem Objektivtubus angegeben: 0,20; 0,40; 0,65 usw.
Die Erhöhung der Auflösung eines optischen Mikroskops durch Reduzierung der Lichtwellenlänge wird durch den Einsatz ultravioletter Strahlung erreicht. Zu diesem Zweck gibt es spezielle Ultraviolettmikroskope mit Quarzoptik und Geräte zum Beobachten und Fotografieren von Objekten. Da diese Mikroskope Licht mit einer Wellenlänge verwenden, die etwa halb so groß ist wie die des sichtbaren Lichts, sind sie in der Lage, Arzneimittelstrukturen mit Abmessungen von etwa 0,1 μm aufzulösen. Die UV-Mikroskopie hat noch einen weiteren Vorteil: Sie ermöglicht die Untersuchung ungefärbter Präparate. Die meisten biologischen Objekte sind im sichtbaren Licht transparent, weil sie es nicht absorbieren. Sie absorbieren jedoch selektiv im ultravioletten Bereich und sind daher unter ultravioletten Strahlen gut sichtbar.
Ein Elektronenmikroskop hat die höchste Auflösung, da die Wellenlänge eines sich bewegenden Elektrons 1000-mal kleiner ist als die Wellenlänge des Lichts.
Nützliche Mikroskopvergrößerung begrenzt durch sein Auflösungsvermögen und das Auflösungsvermögen des Auges.
Die Auflösung des Auges wird durch den kleinsten Blickwinkel charakterisiert, bei dem das menschliche Auge zwei Punkte eines Objekts noch getrennt unterscheiden kann. Sie wird durch die Beugung an der Pupille und den Abstand zwischen den lichtempfindlichen Zellen der Netzhaut begrenzt. Für ein normales Auge beträgt der kleinste Sehwinkel 1 Minute. Befindet sich ein Objekt in der Entfernung der besten Sicht von 25 cm, dann entspricht dieser Winkel einem Objekt mit einer Größe von 70 Mikrometern. Dieser Wert gilt als Auflösungsgrenze des bloßen Auges Z r im besten Betrachtungsabstand. Es hat sich jedoch gezeigt, dass der optimale Wert Z r gleich 140-280 Mikrometer. In diesem Fall erfährt das Auge die geringste Belastung.
Nützliche Mikroskopvergrößerung Sie nennen es die maximale Vergrößerung, bei der das Auge noch Details erkennen kann, deren Größe der Auflösungsgrenze des Mikroskops entspricht.
Die lineare Vergrößerung eines Mikroskops ist gleich dem Verhältnis der Bildgröße eines Objekts, das sich in bester Sichtweite befindet, zur Größe des Objekts selbst (siehe Formel 1). Nehmen wir die Auflösungsgrenze des Mikroskops als Größe des Objekts Z und für die Bildgröße – die Auflösungsgrenze des bloßen Auges in der Entfernung mit der besten Sicht Z r, dann erhalten wir die Formel für die nutzbare Vergrößerung eines Mikroskops:
Einsetzen in diese Formel Z Aus Ausdruck (9) erhalten wir
. (11)
Setzt man in Formel (11) eine Lichtwellenlänge von 555 nm (555×10 -9 m) ein, so liegen die optimalen Werte der Augenauflösungsgrenzen bei 140-280 µm (140-280×10 -6 m). Bereich nützlicher Vergrößerungswerte des Mikroskops
500 A < ZU P< 1000 A .
Wenn beispielsweise die besten Immersionsobjektive mit einer numerischen Apertur von 1,43 verwendet werden, liegt die nützliche Vergrößerung bei 700–1400, was zeigt, dass es nicht praktikabel ist, optische Mikroskope mit hoher Vergrößerung zu konstruieren. Derzeit hat dieses Thema jedoch aufgrund der weit verbreiteten Verwendung eines Elektronenmikroskops in Biologie und Medizin, das eine Vergrößerung von bis zu 600.000 und eine Auflösungsgrenze von bis zu 0,1 nm bietet, an Dringlichkeit verloren.
